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Miranda Vergara, María Cristina - Capítulo 6. Resultados - Análisis de las propiedades de transporte de una mutante del transportador AtCAX1 expresado en levadura -- Licenciatura en Biología. - Departamento de Química y Biología. - Escuela de Ciencias, - Universidad de las Américas Puebla.


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6.
RESULTADOS 6.1 Crecimiento de cepas de levadura en medio selectivo Se verificó la transformación estable de las cepas de levadura K667, sCAX1 y H338N por el crecimiento de las colonias de levadura en medio selectivo sin los aminoácidos uracilo o histidina o triptofano y leucina (Figuras 6.1).
Solamente las cepas que tuvieran el vector de expresión con los insertos, como se especifica en el capítulo de Material y Métodos, podrían crecer en este medio deficiente en nutrientes.
Toda la siembra y resiembra posterior de las cepas de levadura utilizadas durante el estudio, se llevó a cabo en medio sin histidina para su selección. 6.2 Crecimiento de cepas de levadura en calcio y metales pesados Para determinar si la mutación en la 4ª histidina de sCAX1 alteró la capacidad del transporte de calcio del intercambiador Ca2+-H+, se midió de manera indirecta el transporte de calcio al analizar la sensibilidad de la cepa mutante al calcio en medio selectivo conteniendo 200 mM de CaCl2.
El crecimiento de la mutante fue comparado con el crecimiento de la cepa K667, la cual carece de todos los transportadores vacuolares endógenos para calcio, y con la cepa sCAX1, que ha sido transformada con el intercambiador de Arabidopsis Ca2+-H+ CAX1 al que le fue removido el dominio autoinhibitorio N-terminal para hacerlo constitutivamente activo (Pittman & Hirschi, 2001).
Se inocularon las cepas en diluciones seriadas en cajas petri con medio YNB-His en la ausencia (-Ca2+) o presencia de calcio (+Ca2+), a una concentración de 200 mM de CaCl2 (Figura 6.2). 28 Figura 6.1.
Crecimiento de las cepas de levadura sCAX1 y H338N en diferentes medios selectivos. Las cepas de levadura fueron sembradas en cajas petri con YNB, 2 % glucosa y 0.8 % agar en la ausencia del o de los aminoácidos indicados para la selección de levaduras con transformaciones estables.
Izquierda, cepa sCAX1.
Derecha, cepa H338N.
Las cajas de petri fueron incubadas a 30º C por 48 horas. K667 sCAX1 H338N - C...






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