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Miranda Vergara, María Cristina - Capítulo 5. Materiales y métodos - Análisis de las propiedades de transporte de una mutante del transportador AtCAX1 expresado en levadura -- Licenciatura en Biología. - Departamento de Química y Biología. - Escuela de Ciencias, - Universidad de las Américas Puebla.


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5.
MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Cepas de levadura, Vectores y Manipulaciones al DNA Se trabajó con la levadura Saccharomyces cerevisiae, específicamente con la cepa K667 (cnb1::LEU2 pmc1::TRP1 vcx1) con las mutaciones adicionales his3-11 y ura3-11, que se usó para expresar las construcciones que contienen a sCAX1 y la mutante His338Asn.
Los insertos se transfirieron al vector shuttle piHGpd (Nathan et al., 1999) para que pudiera ser expresado en levadura.
Los plásmidos se introdujeron por el método de transformación de acetato de litio-polietilen glicol (Gietz et al., 1995).
Las cepas fueron manipuladas y transformadas por el Dr.
Toshiro Shigaki en los Laboratorios de Fisiología Vegetal del USDA-ARS Children´s Nutrition Research Center, Departamento de Pediatría, Baylor Collage of Medicine, USA. Las diferentes cepas de levadura se tenían inoculadas en cajas petri con medio para levadura con base de nitrógeno (YNB; Difco, Becton and Dickinson, México), con un complemento de aminoácidos sin histidina (Sigma, México) 2% glucosa y 0.8% agarosa y eran reinoculadas con frecuencia para mantener frescos los cultivos. 5.2 Ensayo de crecimiento que demuestra la tolerancia de las cepas de levadura a calcio y metales pesados Una colonia de cada cepa, sCAX1, H338N y K667 fue inoculada en 20 mL de medio líquido de YNB –His y los matraces fueron colocados en un agitador (320 rpm) a 30 ºC por 8 horas.
Después de transcurridas las 8 horas, procurando que la densidad óptica (OD 600ηm) fuera de alrededor de 1.5, los cultivos líquidos fueron retirados del agitador y se hicieron diluciones seriadas con el propio medio, diluyendo el cultivo 5 veces cada vez, contando al final con cinco diluciones 1-5, 1-25, etc.
Cuatro µL de cada una de las 21 diluciones seriadas de los cultivos de levadura fueron inoculados en cajas petri que contenían YNB –His, 2% glucosa y 0.8% agar con la concentración apropiada del calcio o cloruro metálico. 5.3 Aislamiento de las vesí...






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