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Lobos Sujo, Valeria Natalia - Capítulo 5. Materiales y Métodos - Análisis de las propiedades de transporte de una mutante del transportador AtCAX1 en Nicotiana Tabacum -- Licenciatura en Biología. - Departamento de Ciencias Químico Biológicas. - Escuela de Ciencias, - Universidad de las Américas Puebla.


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5.
MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 Material vegetal, hidroponía y tratamiento con metales pesados Se utilizaron semillas de Nicotiana tabacum L.
cultivo KY14 (WT) y plantas homocigóticas T2 que expresaban la mutación CAX1cd, en la cual His338 se modificó a Ala, bajo el control del promotor 35S o el vector vacío pBIN19 (VEC), obtenido del Dr. Kendal Hirschi del Baylor College of Medicine.
Se sembraron en suelo (Metromix 500, SunGro, USA) y se les proporcionó una solución 0.5X de nutrientes Hoaglands (Hoagland and Arnon, 1938; Apéndice 1), semanalmente.
Se mantuvieron en un invernadero bajo condiciones de luz natural y con una temperatura regulada de 25°C. Después de 4 semanas se trasladaron a contenedores de hidroponía (20 L) con solución de 1.0X Hoaglands (Hoagland and Arnon, 1938) y se trataron con Zn2+ a diferentes concentraciones (250 µM, 1 y 2 mM ).
Para evitar la posible variación entre los tratamientos, y efectos del posicionamiento de los contenedores, en un mismo contenedor de 20 L había una planta de cada uno de los tres tipos (WT, Vector y CAX1cd; ver figura 6.1) y se aplicó una concentración distinta de Zn2+ a cada contenedor durante el tiempo indicado. 5.2 Medición de Zn2+ en hojas. Se midió la concentración de Zn2+ en las hojas por el método de Zincon (Liu et al., 1995).
Para este propósito, se tomaron hojas jóvenes y maduras por separado, se cortaron finamente en fragmentos al azar usando distintas partes de la hoja y evitando las venas mayores y se transfirieron a un tubo Eppendorf previamente pesado.
Se pesaron nuevamente los tubos con fragmentos de hoja para obtener el peso fresco y se añadió 0.5 ml 2% (p-v) de ácido sulfosalicílico y se digirió durante 24 horas, seguido de una centrifugación a 14 000 rpm durante 20 min en una microcentrífuga de mesa 18 (Figura 1).
Se usaron 20 μL de la digestión, a los que se le añadieron a 750 μL de un buffer de borato de potasio (100 mM ácido bórico, 100 mM KCl, pH 9.6) seguido po...






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