en fr NucS Activity Studies at the Single Molecule Level Etude de lactivité de lenzyme de réparation NucS à léchelle de la molécule unique Report as inadecuate




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1 LOB - Laboratoire d-optique et biosciences

Abstract : As DNA reparation enzymes are essential to preserve genome integrity, understanding the regulation pathway dynamics is crucial. Pyrococcus Abyssi NucS is a recently discovered nuclease acting on branched DNA substrates with free ssDNA extremities, called flaps. The biochemical characterization of NucS has shown a nanomolar affinity for both 5- and 3- flaps with the existence of two DNA binding sites site I and II as well as a bidirectional activity characterized by the ability to cleave both 5 -and 3 - flaps. The mechanisms that are responsible for this activity, particularly its association and dissociation modalities, however, remain poorly understood. In order to probe the dynamics of NucS interactions with its substrate, we set up a total internal reflection fluorescence microscope that allows the detection and tracking of single interaction events between fluorescently labeled NucS and DNA substrates tethered to a glass surface. Using Quantum dots, we furthermore developed a new colocalization technique based on multilateration that allows for drift correction and colocalization with an accuracy of 50 nm. In our experiments, we investigated the association and dissociation kinetics of the protein-DNA complex and studied the mechanism that regulates the activity of the NucS at different conditions. First, we report a bidirectional and oriented binding on 3- and 5- flaps and reveal that NucS-DNA dissociation follows a mechanism that is not dependent on NucS diffusion on ssDNA towards the junction but rather by the NucS-ssDNA energy landscape. We moreover demonstrated a central role of salt concentration in the modulation of NucS-DNA interactions. Second, we show that the dissociation mechanism follows single step process with one rate limiting dissociation constant and conclude that NucS can stochastically unbind its substrate in non cleavage conditions at 23 ◦ C. Thereafter, we studied the association and dissociation kinetics of the NucS-DNA complex at 45 ◦ Cin the presence of the repair cofactor PCNA. We demonstrated that PCNA increases the NucS association rate for 3 -and 5- substrates. This indicates that PCNA acts as a platform that facilitates the recognition of the lesion and the specific loading of NucS at the junction. In addition, we showed that PCNA destabilizes the NucS-DNA complex, presumably by exerting a force to bend the DNA in order to load the flap extremity into the active site II. In the case of 5- flaps, we have shown that the dissociation follows a two-step mechanism, which is independent of the flap length. We thus proposed a model where NucS binds its substrate directly at the junction thanks to its site I and then threads the free extremity of the flap into site II for cleavage with the help of PCNA that enables substrate bending. In this model, the observed dissociation kinetics may be due to the dissociation of the two independent binding sites. We also showed that the dissociation of NucS on 3- flaps follows a first-order dissociation process which might be due to the speed of the second step in the proposed mechanism for 5- flaps. Altogether, our results constitute a notable contribution to the characterization of the DNA-NucS interactionsand to thenucleotide excision repair mechanism more generally. The methods we developed furthermore constitute an original way to probe DNA-protein intramolecular kinetics.

Résumé : Les enzymes de réparation de l-ADN sont des facteurs essentiels pour assurer l-intégrité du génome. Ainsi, la compréhension de la dynamique de leurs mécanismes d-interaction est capitale. NucS est une nucléase récemment découverte chez l-archée Pyrococcus abyssi, qui interagit avec des structures branchées de l-ADN à simple brin libre, appelées flaps. Sa caractérisation biochimique a mis en évidence une affinité nanomolaire pour l-ADN simple brin, avec l-existence de deux sites de liaison site I et II ainsi qu-une activité bidirectionnelle caractérisée par la capacité à cliver les flaps 5- et 3-. Les mécanismes qui sont à l-origine de cette activité, notamment ses modalités de chargement, de localisation et de dissociation, restent toutefois peu connus. Afin de sonder la dynamique des interactions de NucS avec son substrat, nous avons mis en place un microscope à illumination en onde évanescente permettant la détection et le suivi des événements d-interaction individuels entre la protéine marquée avec un fluorophore et un substrat d-ADN attaché à la surface. Nous avons ensuite développé une nouvelle technique de colocalisation qui permet de positionner une protéine individuelle par rapport à son substrat avec une précision de 50 nm pour des durées arbitraires. Nous avons alors étudié la cinétique d-association et de dissociation des complexes NucS-ADN individuels afin de résoudre les mécanismes qui régulent l-activité de l-enzyme dans différentes conditions. Dans des conditions où le clivage est inhibé, nous avons montré que l-association était dépendante du site I, bidirectionnelle et symétrique pour les flaps 3- et 5- et que la dissociation était orientée avec une affinité supérieure pour les flap 5-. Nous avons également montré que la dissociation suivait une cinétique du premier ordre indépendante de la diffusion de NucS sur le flap. Ceci indique que, dans ces conditions non clivantes, NucS s-associe et-ou se dissocie à des positions arbitraires sur le flap. Par la suite, nous avons étudié la cinétique d-association et de dissociation du complexe NucS-ADN à 45 ◦ C en présence du cofacteur de la réparation PCNA. Nous avons démontré que PCNA augmente la vitesse d-association de NucS avec les substrats 3- et 5-. Ceci indique que PCNA agit comme une plateforme qui facilite la reconnaissance de la lésion, avec un chargement ciblé de NucS à la jonction. De plus, nous avons montré que PCNA déstabilise le complexe NucS-ADN, vraisemblablement en exerçant une force pour plier l-ADN afin d-amener l-extrémité du flap vers le site II. Dans le cas de flaps 5-, nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme en deux étapes, qui est indépendant de la longueur du flap. Ceci nous a permis de proposer un modèle où NucS se charge par son site I directement à la jonction, courbe le substrat pour capturer l-extrémité simple brin par le site II pour le cliver. Dans le cas d-un flap 3-, nous avons montré que la dissociation suit un mécanisme du premier ordre ce qui est probablement dû à la rapidité de la seconde étape dans le mécanisme proposé pour les flaps 5-. Nos résultats constituent ainsi une nouvelle contribution à la caractérisation intramoléculaire des interactions NucS-ADN. Les méthodes que nous avons développées constituent en outre un moyen original pour sonder la cinétique des interactions entre biomolécules et pourront être appliquées à de multiples systèmes.

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Keywords : Reparation Enzymes DNA Protein Interaction single-molecule TIRF-Microscopy

Mots-clés : Enzyme de réparation Pyrococcus Abyssi Interaction ADN-Protéine molécule unique onde évanescente





Author: Rachid Rezgui -

Source: https://hal.archives-ouvertes.fr/



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