Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus PYVV en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja Report as inadecuate




Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus PYVV en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja - Download this document for free, or read online. Document in PDF available to download.

57 Ciencias de la vida; Biología - Life sciences; biology

Potato vein yellow virus PYVV es un virus reemergente que infecta a la especie Solanum tuberosum en algunos países andinos causando pérdidas importantes en la producción. El virus ha sido detectado por RT-PCR convencional y en sólo dos ocasiones se ha reportado el uso de PCR en tiempo real para el diagnóstico del virus. No existen estudios sobre la distribución y acumulación de PYVV en diferentes órganos de una planta infectada, por lo tanto no se sabe si la distribución del virus en plantas infectadas es homogénea ó heterogénea. Teniendo en cuenta lo anterior el objetivo del presente trabajo fue evaluar la distribución y acumulación viral del PYVV en muestras de tubérculos y otros órganos de plantas de Solanum tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas con el virus. Se hizo cuantificación absoluta utilizando la técnica de RT-PCR en tiempo real qRT-PCR con Sondas TaqMan® la cual requiere tener un RNA de buena calidad y cantidad, por lo tanto inicialmente se hizo una evaluación de tres métodos de extracción para el aislamiento de RNA a partir de diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja Variedad Criolla Colombia infectadas con el virus foliolo, peciolo, tallo, pedúnculo floral, antera, pétalo, raíz y brote de tubérculo. La evaluación se hizo en términos del rendimiento, radio de las absorbancias 260-280nm, radio de la intensidad de las bandas de las subunidades ribosomales 28S-18S, y la amplificación del gen de la proteína mayor de la cápside CP de PYVV; los métodos evaluados fueron: Trizol® Invitrogen, fenol:cloroformo seguido de purificación con Sephadex y un método basado en CTAB. Aunque con los tres métodos se logró la detección del virus en los diferentes órganos evaluados, los resultados sugirieron que Trizol® Invitrogen era el mejor método para la extracción de RNA a partir de diferentes órganos, debido a que este presentó la mayor probabilidad de obtener un mayor rendimiento y relación 260-280nm, y se logró la detección del virus por RT-PCR en un mayor número de muestras que con los otros dos métodos de extracción Posteriormente se analizó la acumulación del virus en diferentes órganos de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja variedad Criolla Colombia infectadas por transmisión con el vector natural, en donde PYVV presentó una distribución homogénea en plantas que no expresaban síntomas de amarillamiento, mientras que las plantas que expresaron síntomas de amarillamiento presentaron una distribución diferencial heterogénea entre la zona aérea y la zona radical con mayor acumulación en la zona aérea. En tubérculos el virus también se distribuye heterogéneamente cuando las muestras provienen de plantas que no expresan síntomas. Es la primera vez que se detecta PYVV en muestras de diferentes órganos de plantas infectadas. La información presentada en este trabajo puede resultar interesante para el conocimiento del virus distribución del virus en el hospedero y puede ser importante en programas de fitomejoramiento, indexado de plantas contra PYVV, programas de cuarentena y certificación de semillas libres de virus., Abstract. Potato yellow vein virus PYVV is a re-emerging virus that infects the specie Solanum tuberosum in some Andean countries causing significant losses in production. The virus has been detected by conventional RT-PCR and in only two cases have been reported using real-time RT-PCR for the diagnosis of the virus. There is not studies on the distribution and accumulation of PYVV in different organs of a plant infected, therefore, it is not known if the distribution of the virus in infected plants is homogeneous or heterogeneous. Considering the above, the aim of this study was to evaluate the distribution and accumulation of PYVV in tubers and other plant organs of Solanum tuberosum Group Phureja variety Criolla Colombia infected with the virus. Absolute quantification was made using real time RT-PCR technique qRT-PCR with TaqMan® probes which requires having a good RNA quality and quantity, Initially was made an evaluation of three methods for RNA extraction from various organs of plants S. tuberosum Group Phureja cultivar Colombia Criolla infected with the virus leaflet, petiole, stem, peduncle, anther, petal, root and tuber shoot. Evaluations were made in terms of yield, ratio of 260-280nm absorbance, radio of intensity bands of ribosomal subunits 28S-18S, and the amplification of gene major capsid protein CP of PYVV. The evaluated methods were: Trizol ® Invitrogen, phenol: chloroform followed by purification with Sephadex and a CTAB-based method. Although all three methods are able to detect the virus in different organs evaluated, the results suggested that Trizol ® Invitrogen was the best method for extracting RNA from different organs, because this had the highest probability of obtain a higher yield and 260-280nm ratio, and detection was achieved by RT-PCR virus in a greater number of samples than the other two methods of extraction. Subsequently, the virus accumulation was analyzed in different organs of plants S. tuberosum Group Phureja cultivar Criolla Colombia infected by transmission using the natural vector. A homogeneous distribution of PYVV was presented in plants not expressing symptoms of yellowing, while plants pexressin yellowing symptoms showed differential distribution heterogeneous between the aerial zone and the radical zone with higher accumulation in the aerial zone. In tubers the virus was also distributed heterogeneously in samples from plants that do not express symptoms. It is the first report of detection of PYVV in samples from different organs of infected plants. The information presented in this paper could be interesting for increase the knowledge of the virus virus distribution in the host and could be important in breeding programs, indexed plants against PYVV, quarantine programs, and certification of virus-free seed.

Tipo de documento: Tesis-trabajos de grado - Thesis Maestría

Colaborador - Asesor: Guzmán Barney, María Mónica

Información adicional: Magíster en Bioquímica. Línea de Investigación Virus Vegetales

Palabras clave: PYVD, Distribución, RT-PCR en tiempo real , RT-PCR, Sondas TaqMan, Cuantificación absoluta , Diferentes órganos, Distribution , Real time RT-PCR, RT-PCR , TaqMan® proof, Absolute quantification, Different organs

Temática: 5 Ciencias naturales y matemáticas - Science 57 Ciencias de la vida; Biología - Life sciences; biology6 Tecnología ciencias aplicadas - Technology 61 Ciencias médicas; Medicina - Medicine and health6 Tecnología ciencias aplicadas - Technology 63 Agricultura y tecnologías relacionadas - Agriculture6 Tecnología ciencias aplicadas - Technology 66 Ingeniería química y Tecnologías relacionadas- Chemical engineering





Source: http://www.bdigital.unal.edu.co


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Anexo A: Métodos de extracción de RNA Anexo A.1: Extracción de RNA total con Trizol® (Invitrogen) Anexo A.1.1 Extracción: 1.
Pulverizar 100mg de material vegetal con Nitrógeno líquido. 2.
Homogenizar el material vegetal con 1ml de Trizol® (Invitrogen) e incubar a temperatura ambiente durante 5min. 3.
Centrifugar durante 15min a 12000rpm a 4°C y transferir la fase acuosa a un tubo de reacción nuevo. 4.
Adicionar 0.2ml de cloroformo, agitar vigorosamente a incubar a temperatura ambiente durante 3min. 5.
Repetir paso 3. Anexo A.1.2 Precipitación de RNA: 1.
Adicionar 0.5ml de isopropanol e incubar overnight a 4°C. 2.
Centrifugar durante 15min a 12000rpm a 4°C y eliminar el sobrenadante. 3.
Adicionar 1ml de etanol absoluto, agitar vigorosamente y centrifugar durante 5min a 7500rpm a 4°C, eliminar el sobrenadante. 4.
Adicionar 1ml de etanol 70%, agitar vigorosamente y centrifugar durante 5min a 7500rpm a 4°C, eliminar el sobrenadante. 120 Detección y cuantificación del Potato yellow vein virus (PYVV) en aislamientos de diferentes órganos de Solanum tuberosum Grupo Phureja 5.
Dejar secar el pellet de RNA y resuspender en 30µl de agua DEPC. 6.
Incubar durante 10min a 65°C. 7.
Almacenar los extractos a -20°C hasta su procesamiento. Anexo A.2: Extracción de RNA total con CTAB (López et al., 2006) Anexo A.2.1 Composición de buffers: - Buffer de maceración CTAB (Esterilizar por autoclavado) 2% CTAB 100mMTris-HCl, pH 8.0 20mM EDTA, pH 8.0 1.4M NaCl 1% Na2SO3 2% PVP-40 - Buffer TE-SDS (Esterilizar por autoclavado) 10mM Tris-HCl, pH 8.0 1mM EDTA, pH 8.0 1% (p-v) SDS Anexo A.2.2 Extracción: 1. Pulverizar 150mg de material vegetal con Nitrógeno líquido. 2.
Homogenizar el material vegetal con 1.5ml de buffer de maceración CTAB e incubar durante 10min a 65°C. 3.
Adicionar un volumen igual de cloroformo:isoamilalcohol (24:1 v-v) y centrifugar durante 15min a 12000rpm a 4°C.
Transferir la fase acuosa a un tubo de reacción nuevo. Anexo A.
Mé...






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