en fr Droplet-based microfluidic systems to incorporate nucleic acids into cationic liposomes and to transfect mammalian cells in vitro Système microfluidique de gouttes pour incorporer des acides nucléiques dans des liposomes Report as inadecuate




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1 LadHyX - Laboratoire d-hydrodynamique

Abstract : This work aims to use one droplet-based microfluidic systems to incorporate nucleic acids into cationic liposomes and another one to study the mammalian cell transfection process. For this, the first step uses a droplet-based microfluidic system to complex cationic liposomes with pDNA in order to obtain reproducible and suitable lipoplexes to dendritic cells DCs transfection. For this purpose, some experimental parameters are investigated, such as inlet flow rates, the maintenance of liposomes’ properties after microfluidic processing, lipoplex characteristics size, polydispersity and zeta potential as function of molar charge ratio R+- and microchip design. Then, lipoplexes produced in selected conditions: a microchip with large serpentine channel and split region, which decreases lipoplex polydispersity, operating at ratio aqueous-oil flow rate 0.25 and R+- 1.5, 3, 5, 7 and 10; are used to transfect DCs in vitro. All lipoplexes transfect DCs while providing cells activation. The second step uses a single-cell microfluidic platform to investigate and control over the transfection conditions, in view of optimizing the recombinant protein production by transfected cells. In this context, Chinese hamster ovary cells CHO-S are transfected in microchip with different types of lipoplexes R+- 1.5, 3, 5 and monitored by green fluorescent protein GFP production and cell viability. The single-cell platform enables to assess the heterogeneities of CHO-S population, revealing the presence of a subpopulation producing significantly high levels of GFP. These high producers HP show increased cell size in comparison to the average population. Moreover, the charge of lipoplexes shows an important role to transfect CHO-S, since the unique positive charged lipoplex R+- 5 produces more HPs. Additionally, the amount of pDNA delivered affects the protein production, since R+- 1.5 with more pDNA increase GFP specific productivity of HPs. This thesis is a co-supervised program between University of Campinas, Brazil and École Polytechnique, France. In general, this work contributes to microfluidics and gene delivery areas.

Résumé : Ce travail consiste à utiliser deux systèmes microfluidiques de gouttes pour incorporer d-une part des acides nucléiques dans des liposomes cationiques et d-autre part étudier la dynamique de transfection dans des cellules mammifères. La première micropuce permet d-insérer de l-ADN dans des liposomes cationiques afin d-obtenir de manière reproductible des lipoplexes appropriés à la transfection de cellules dendritiques DC. Plusieurs paramètres expérimentaux sont tout d-abord étudiés, tels que les débits d-entrée, l’entretien des propriétés des liposomes après leur traitement dans des micro-gouttes, les caractéristiques des lipoplexes taille, polydispersité et charge en fonction du rapport molaire de charge R+- et de la géométrie de la puce. Ensuite, les lipoplexes produits dans des conditions optimisées: une micropuce avec un grand canal en serpentin et une région de division des gouttes qui diminuent la polydispersité des lipoplexes, fonctionnant à un rapport de débit eau-huile 0,25 et R+- 1,5; 3; 5; 7 et 10; sont utilisés pour transfecter des DCs in vitro. Tous les lipoplexes transfectent les DCs, tout en offrant une activation des DCs. La seconde étape consiste à utiliser une micropuce à l-échelle de la cellule unique afin de contrôler les conditions de transfection et d-optimiser le rendement de production de protéines recombinantes. Ainsi, des cellules ovariennes de hamster Chinois CHO-S sont transfectées dans la micropuce avec différents types de lipoplexes R+- 1,5; 3; 5 dont la dynamique de transfection est suivie par la production de protéines vertes fluorescentes GFP et par la viabilité cellulaire. Cette micropuce a permis d-évaluer l’hétérogénéité des cellules transfectées, révélant la présence d-une sous-population produisant des niveaux particulièrement élevés de GFP. Ces hautes productrices HP ont une taille cellulaire plus importante que celle de la population moyenne. La charge des lipoplexes montre un rôle important pour transfecter CHO-S, puisque l’unique lipoplex chargé positif R+- 5 produit plus de HPs. La quantité d’ADN délivrée influe sur la production de protéine, puisque R+- 1,5 avec plus d’ADN augmente la productivité spécifique de GFP des HPs. Cette thèse est réalisée dans le cadre d-un programme de co-tutelle entre l-Université de Campinas, au Brésil, et l-École Polytechnique, en France. Ce travail a principalement contribué aux domaines de microfluidique et de délivrance de gènes.

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Keywords : CHO cells Dendritic cells Nucleic acids Gene delivery Cationic liposomes Droplet microfluidics

Mots-clés : Microfluidique des gouttes Liposomes cationiques Délivrance de gènes Cellules CHO Cellules dendritiques Acides nucléiques





Author: Micaela Vitor -

Source: https://hal.archives-ouvertes.fr/



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