Expresión de histonas H2A de fenotipo silvestre y mutantes en epimastigotes de Trypanosoma cruziReport as inadecuate




Expresión de histonas H2A de fenotipo silvestre y mutantes en epimastigotes de Trypanosoma cruzi - Download this document for free, or read online. Document in PDF available to download.

Profesor guía

Cabrera Vallejos, Gonzalo; - Resumen

Trypanosoma cruzi, un protozoo hemoflagelado, es el agente causal de la enfermedad deChagas, patología endémica de Latinoamérica que se ha extendido al resto del mundo. Esteparásito presenta un ciclo de vida indirecto y se transmite principalmente mediante insectoshematófagos triatominos a distintos hospederos mamíferos, incluyendo el ser humano.Dentro de los mecanismos no vectoriales de transmisión de la enfermedad, los másimportantes son la transfusión sanguínea y la infección transplacentaria. La enfermedadcursa en tres fases progresivas: aguda, indeterminada y crónica, pudiendo causardiscapacidad e incluso la muerte. Las drogas utilizadas como tratamiento de esta patologíason poco eficaces en el tratamiento de la fase crónica, además de generar numerososefectos colaterales indeseados, siendo necesario desarrollar nuevas drogas más eficientes enla eliminación del parásito y más inocuas para el paciente.Para que se establezca una infección crónica, T. cruzi debe resistir el daño oxidativo alDNA generado por las células del hospedero. La sobrevida de los parásitos se relacionaríacon la capacidad de reparación del DNA, donde en el caso de mamíferos la fosforilación dela histona H2AX en el residuo Ser139 sería fundamental. En tripanosomátidos no se hanidentificado genes ortólogos para H2AX, pero en T. brucei se detectó que la histona H2Acanónica es fosforilada en el residuo Thr130 como consecuencia de daño al DNA, residuoque se conserva en otros tripanosomátidos y que en el caso de T. cruzi corresponde aThr131. La participación de este último en la respuesta al daño del DNA aún no se hacomprobado.Se realizaron tres mutaciones sitio-dirigidas diferentes en la secuencia nucleotídica quecodifica para el residuo Thr131 de H2A de T. cruzi, reemplazándolo por alanina incapaz deser fosforilada, ácido glutámico y ácido aspártico que simulan una fosforilaciónpermanente del sitio. Las secuencias nucleotídicas silvestres y mutantes fueron insertadasen el vector pTREX-HIS8-GFP y expresadas como proteínas de fusión con GFP enepimastigotes de T. cruzi.Se comprobó la expresión exitosa de las proteínas en T. cruzi mediante visualizacióndirecta por microscopía de fluorescencia, inmunofluorescencia y mediante ensayos deviWestern blot. Las histonas marcadas con GFP se localizan a nivel de núcleo, lo cual sugiereuna asociación con la cromatina del parásito, debiendo confirmarse su incorporaciónefectiva al nucleosoma mediante estudios posteriores. Otra tarea a futuro consiste endeterminar si efectivamente el residuo Thr131 de H2A de T. cruzi se fosforila comorespuesta al daño del DNA.Los resultados permiten concluir que es posible generar líneas de epimastigotes de T. cruzique expresen de manera estable la histona H2A tanto de fenotipo silvestre como defenotipos mutantes para el residuo Thr131, utilizando el vector pTREX-HIS8-GFP. Losepimastigotes que expresan estas proteínas se encuentran disponibles para realizar ensayosde viabilidad comparativa frente a la exposición con agentes genotóxicos, lo que podríadeterminar un posible nuevo blanco terapéutico para la enfermedad de Chagas.Nota general

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario



Author: Julio Kalajzic, Bernardita; -

Source: http://repositorio.uchile.cl/



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